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普洱茶优势菌株黑曲霉的分离及其功能和安全性研究

文档作者：周才碧1, 陈文品1*, 吴钟玲2, 张敏星1, 管俊岭1, 李涛1, 穆瑞禄1 ( 文档来源： 1. 华南农业大学园艺学院茶叶科学系 2. 广州质量监督检测研究院		点击数：	更新时间： 2025年07月20日
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第6 卷 第3 期 食品安全质量检测学报 Vol. 6 No. 3
2015 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2015
基金项目: 国家自然科学基金项目(31270725)
Fund: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31270725)
*通讯作者: 陈文品, 副教授, 主要研究方向为茶叶加工与安全。E-mail: cwptea@scau.edu.cn
*Corresponding author: CHEN Wen-Pin, Associate Professor, Tea Science Department, Horticultural College, South China Agricultural
University, No.483, Wu-Shan Road, Tian-He District, Guangzhou 510642, China. E-mail: cwptea@scau.edu.cn
普洱茶优势菌株黑曲霉的分离及其功能和
安全性研究
周才碧1, 陈文品1*, 吴钟玲2, 张敏星1, 管俊岭1, 李涛1, 穆瑞禄1
(1. 华南农业大学园艺学院茶叶科学系, 广州 510642; 2. 广州质量监督检测研究院, 广州 510642)
摘要: 目的了解黑曲霉在普洱茶渥堆发酵中的功能和安全性。方法 利用平板涂布法从普洱茶中分离、纯
化得优势菌株S6, 通过分子鉴定为黑曲霉; 将黑曲霉按照悬浮液107 个/mL, 接种于潮水量35%的云南大叶种
晒青毛茶, 30 ℃、发酵25 d 制备得发酵茶样, 按照GB 22111-2008 进行感官、理化和安全性评价。结果 优势
菌株黑曲霉纯种发酵的茶样香气浓纯、汤色黑褐色、滋味较平和, 达到三级茶叶标准要求, 对比对照茶样, 具
有茶褐素、红度和黄度等变化较为深刻, 且赭曲霉毒素的含量为3.80 μg/kg, 低于国内外限量。结论 优势菌
株黑曲霉可以作为发酵用菌种, 适于普洱茶的渥堆发酵, 发酵样的安全性高。
关键词: 普洱茶; 黑曲霉; 分离; 鉴定; 赭曲霉毒素; 安全性
Research on identification, function and safety of Aspergillus Niger, a
preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea
ZHOU Cai-Bi1, CHEN Wen-Pin1*, WU Zhong-Ling2, ZHANG Min-Xing1, GUAN Jun-Ling1,
LI Tao1, MU Rui-Lu1
(1. Department of Tea Science, College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2. Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 510642, China)
ABSTRACT: Objective To understand the function and safety of Aspergillus niger during the fermentative
process of Pu'er tea. Methods The preponderant fungus S6 was separated and purified from Pu'er tea in the
plate method, and it was Aspergillus niger through the use of molecular identification. Then Aspergillus niger,
following suspension 107/mL, was inoculated on the sun-dried green tea with 35% water, cultured for 25 d with
30 ℃, then the sensory, security, physical and chemical evaluations of fermented sample were operated
according to GB 22111-2008. Results The research results showed that compared with CK, the content of the
tea sample in fermentation of Aspergillus niger was the abrownins, redness and brightness. It was achieved the
third standard and was changed significantly in the fermented sample with sweet aroma, black brown tang,
velvety flavor, and the content of ochratoxin was 3.80 μg/kg under the limitation of home and abroad.
Conclusion Aspergillus niger is one of preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea, and
plays a very important role to the formation of Pu'er tea quality with high safety.
KEY WORDS: Pu'er tea; Aspergillus niger; separation; identification; ochratoxin; safety
第3 期 周才碧, 等: 普洱茶优势菌株黑曲霉的分离及其功能和安全性研究 1007
1 引 言
普洱茶是云南大叶种晒青毛茶在湿热作用和微
生物酶促作用下形成一种特种茶叶, 微生物的发酵作
用在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用, 是云南
普洱茶品质形成的必要条件[1], 而黑曲霉(Aspergillus
niger)是普洱茶渥堆的发酵优势菌株之一[2]。
普洱茶具有降脂[3]、抗氧化[4]、抗过敏[5]、降血
糖[6]、抗肿瘤、抗病毒[7]、逆转免疫衰老[8]等功能, 其
自身的卫生品质是决定普洱茶产品能否被安全食用、
能否作为商品的基本条件, 也是普洱茶产业可持续
发展的前提[9]。但普洱茶渥堆发酵过程是一个多种微
生物混合发酵体系, 有多种微生物毒素残留的可能。
微生物毒素具有器官毒性、细胞毒性、分子毒性、
遗传毒性和联合毒素, 使机体产生免疫机能下降、生
长受阻、生产性能减弱、抗病力降低、神经毒性和致
癌性等危害[10], 甚至中毒致死, 而且一般微生物毒
素的化学结构都很稳定, 很难去除[11]。
赭曲霉毒素(ochratoxin, OCT)是由曲霉属[12,13]或
青霉产生的有毒代谢产物, 在湿度较高的条件下才
能产生[14], 以OCTA、OCTB 和OCTC 等7 种结构类
似的化合物为主[15], AFT、AFB1 和OTA 在50℃温水
中易浸出, 且表现在植物间相互传递和感染的现象
[16]。常污染粮食、花生、蔬菜、高粱[17]和咖啡豆等
农作物[18-21], 及酵母片也有检出[22], 且从市售的红
茶和普洱茶中尚未检测到曲霉菌株产生的赭曲霉毒
素A 和伏马毒素[23]。OCT 主要侵害动物肝脏与肾脏,
抑制动物细胞有丝分裂, 有致畸和致癌作用, IARC
将其定为2B 类致癌物。谷物及其制品、豆类及其制
品中OCTA 的限量不得超过5 μg/kg[24], 动物饲料中
限量范围在100~1000 μg/kg 之间, 根据世界卫生组
织(WHO), OCTA 在谷物中的最高浓度应为5 μg/kg。
目前, 对于普洱茶中黑曲霉的分离、鉴定和功能
性以及安全性方面的研究未见报道。在普洱茶生产、
运输和陈化过程, 有曲霉属菌株的参与, 普洱茶中存
在产生赭曲霉毒素的可能性, 因此对普洱茶优势菌
株黑曲霉的功能和安全性研究有特别重要的意义。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 仪器与设备
SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台(苏州净化设
备有限公司), 恒温恒湿培养箱(宁波江南仪器厂), 立
式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司), RE-52A
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), AB204-N 电子分
析天平, THA-82A 台式恒温震荡仪, DGX-9143B-2 型
数码电热鼓风干燥箱(上海福马实验设备有限公司),
SMART 生物显微镜( 重庆奥特光学有限公司),
HWS28 型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司),
UV5100 型 紫外可见分光光度计(上海元析一起有限
公司), 岛津LC20A 型高效液相色谱仪等。
2.1.2 样品与试剂
陈年普洱茶饼(七彩云南)、云南大叶种晒青毛茶
(云南勐宋)、桔青霉素和赭曲霉毒素标样(Pribolab),
以及查氏琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基等。
2.2 实验方法
2.2.1 菌株分离和鉴定
2.2.1.1 菌株分离和形态鉴定
陈年普洱茶饼, 制备10-2~10-7 稀释梯度, 涂布分
离培养菌株, 纯化保藏; 根据初分菌落的形状、大小、
颜色和表面特征等形态特征, 结合《中国真菌志》对
获得的各菌株进行初步的形态鉴定。
2.2.1.2 分子鉴定
采用改良CTAB 法提取菌株DNA; 使用KOD高
保真DNA polymerase 进行PCR 扩增目的片段, 进行
3730XL 常规测序反应, 依照ABI 标准程序操作完成
全序列基因; 在NCBI 数据库中进行比对, 确定菌株
的分类地位, 构建进化树。
2.2.2 发酵茶样制备
制备107 个/mL 上述普洱茶中分离的优势菌株孢
子悬浮液, 接种于潮水量为35%的云南大叶种晒青
毛茶中, 在30 ℃气候箱中培养25 d, 取出进行45 ℃
干燥, 得到普洱茶发酵茶样, 不加菌株发酵茶样为对
照CK。
2.2.3 检测方法
水浸出物, GB/T 8305-2002; 茶多酚, GB/T
8313-2002; 氨基酸, GB/T 8314-2002; 可溶性糖, 蒽
酮比色法; 茶色素, 系统分析法; 色差, 色差仪; 展
青霉素, GB/T 5009.185。
3 结果与讨论
3.1.1 形态鉴定
采用涂布平板, 从陈年普洱茶饼中分离得到优
势菌株S6。S6 在查氏琼脂培养基上菌落生长迅速,
1008 食品安全质量检测学报 第6 卷
28 ℃培养6 d, 菌落在20~30 mm 之间, 菌落较大, 地
毯式蔓延生长, 呈同心轮纹状, 菌落正面黑色, 边缘
产生白色次生菌丝, 反面灰黑色; 在显微镜下观察,
菌丝有隔, 在菌丝的壁厚而膨大成“足细胞”, 产生分
生孢子梗, 无隔, 梗顶端膨大成球状泡囊, 即为分生
孢子头, 菌落和孢子形态见图1。以上培养性状和形
态特征符合黑曲霉的标准形态, 初步命名为黑曲霉
S6(Aspergillus niger S6)。
3.1.2 S6 菌株进化树构建
以真菌基因组DNA 为模板, 利用通用引物扩增获
得ITS 基因的序列(如PCR 图); 利用NCBI 中BLAST
搜索, 得到匹配度较高的已知序列, 利用MEGA 软件
进行多序列比对。结果显示, S6 基因序列与已知的
Aspergillus niger(AB363747.1), 相似度达到99%, 与
Aspergillus nomius 和Aspergillus brasiliensis 的相似度相
对较低, S6 菌株系统进化树结果构建见图2:
其具体分类地位如下:
——界 真菌界Mycota
——门 子囊菌门Ascomycota
——纲 散囊菌纲Eurotiomycetes
——目 散囊菌目Eurotiales
——科 发菌科Trichocomaceae
——属 曲菌属Aspergillus
——种 黑曲霉Aspergillus niger
3.2 黑曲霉对普洱茶发酵茶样的影响
3.2.1 黑曲霉发酵茶样的感官品质
由图3 和表1 可以看出: 与CK相比, 黑曲霉发酵
茶样附有棕、褐色菌体, 香气浓纯、有特殊的蘑菇香,
汤色黑褐色较浑浊, 滋味较平和、无刺激性、无特殊
的口感。结果表明, 黑曲霉菌株107 个/mL 孢子悬浮液
接种于潮水量35%的云南大叶种晒青毛茶中, 30 ℃发
酵25d, 菌落生长旺盛, 对普洱茶影响较深刻。
3.2.2 黑曲霉发酵茶样的成分变化
由表2 和图3 可以看到: 与CK 相比, 黑曲霉发
酵茶样水浸出物、茶多酚、可溶性糖、茶红素、亮度、
的含量呈下降趋势, 变化幅度分别为6.23%、58.2%、
10.3%、59.4%、281.43%; 氨基酸、茶褐素、红度和
黄度的含量呈上降趋势, 变化幅度为64%、633.2%、
552.5%和210.53%。pH 值变化不明显。结果表明, 黑
曲霉渥堆发酵, 对普洱茶发酵茶样的茶褐素、红度和
黄度影响较深刻。
图1 黑曲霉
Fig. 1 Aspergillus niger
图2 PCR 和进化树
Fig. 2 PCR and evolutionary tree
第3 期 周才碧, 等: 普洱茶优势菌株黑曲霉的分离及其功能和安全性研究 1009
表1 发酵茶样的感官审评
Table 1 The sensory evaluation of the fermented sample
菌株 外形 香气 汤色 滋味 叶底
CK 墨色 清香 黄 涩 褐
S6 深棕褐色 蘑菇香 乌褐色、浑 浓厚、平和 褐
图3 发酵茶样及感官审评
Fig. 3 The fermented sample and the sensory evaluation
表2 发酵茶样的成分分析
Table 2 The component analysis of the fermented sample
指标 CK 黑曲霉发酵茶样
水浸出物% 48.161.61 45.181.51
茶多酚% 25.000.83 10.440.35
氨基酸% 2.540.08 4.390.15
可溶性糖% 5.350.18 4.820.16
赭曲霉毒素μg/kg 0.000.00 3.800.13
茶红素 6.040.20 2.500.08
茶褐色 2.990.10 18.900.63
亮度 -7.010.23 -19.450.65
红度 4.210.14 21.950.73
黄度 10.000.33 21.890.73
pH 7.070.24 7.200.24
注: 数据为均值标准误
3.2.3 黑曲霉发酵茶样的安全性
利用HPLC 测定黑曲霉发酵茶样中赭曲霉毒素
的含量, 由表2 知, 赭曲霉毒素的含量为3.80
μg/kg(低于国内外限量5 μg/kg)。结果表明, 黑曲霉在
潮水量35%云南大叶种晒青毛茶中, 30 ℃发酵25 d,
发酵茶样赭曲霉毒素低于国内外限量, 安全性高。
4 结 论
黑曲霉在查氏琼脂培养基上菌落生长迅速,
28 ℃培养6 d, 菌落在20~30mm 之间, 菌落较大, 地
毯式蔓延生长, 呈同心轮纹状, 菌落正面黑色, 边缘
产生白色次生菌丝, 反面灰黑色; 在潮水量35%云
南大叶种晒青毛茶中, 30 ℃发酵25 d, 发酵茶样附
有棕、褐色菌体, 香气浓纯、有特殊的蘑菇香, 汤色
黑褐色较浑浊, 滋味较平和、无刺激性、无特殊的
口感, 茶褐素、红度和黄度等变化较为深刻, 且赭曲
霉毒素低于国内外限量, 安全性高, 适于普洱茶的
渥堆发酵。
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(责任编辑: 白洪健)
作者简介
周才碧, 研究生, 主要研究方向为茶
叶加工与安全。
E-mail: teasky@foxmail.com
陈文品, 副教授, 主要研究方向为茶
叶加工与安全。
E-mail: cwptea@scau.edu.cn

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