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实时荧光PCR技术在食品检验领域的应用

文档作者：窦丽芳　李梦迪　方慧文文档来源：武汉产品质量监督检验所国家饮料及粮油制品质量监督检验中心		点击数：	更新时间： 2025年07月15日
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July 2015 CHINA FOOD SAFETY 137
科技文苑
近年来，全球食品安全面临着潜
在风险和巨大挑战，其中食源性致病
菌、未知有害生物物质、转基因产品
等生物领域成为食品安全风险监测和
控制的重要领域之一。由于自然界的
每一物种都有完全不同于他物种高度
保守的核酸(DNA 和RNA) 序列，以核酸
为载体的实时荧光PCR 技术（Real-Time
PCR），能实现微量核酸的百万倍扩增，
目前公认为核酸检测的金标准。
实时荧光定量PCR 是在传统PCR
技术上发展而来，借助加入反应体系
中荧光基团，通过实时监测荧光信号
的积累从而监测整个PCR 进程，通过
标准曲线或“归一化”数据处理对未
知样品进行绝对或相对定量分析和
定性分析[1]。基于“Ct 值与模板初
始浓度在指数增长期呈现对应关系
的数学原理”，“ 荧光探针的荧光
共振能量转移（FRET，fluorescence
resonance energy transfer, FRET）
的化学原理”和“激光激发，一定波
长连续、多个染料同时监测的光学原
理”建立的Real-Time PCR 技术能满
足食品检测更快速、更灵敏、更特异
的食品筛查检测需求，由于该技术可
以在同一封闭管实现对单个或多个靶
基因同时监测，既节约了检测时间、
增加检测通量，又避免后处理对环境
的污染。同时Real-Time PCR 联合分
子指纹图技术如单链构造多态性(PCRSSCP，
single strand conformation
polymorphisms)、限制性片段长度多态
性（PCR- RFLP restriction fragment
length polymorphisms RFLP)、变性梯
度凝胶电泳（PCR-DGGE， denaturing
gradient gel electrophoresis）、随
机扩增多态性DNA (PCR-RAPD，random
amplified polymorphic DNA) 和质谱
技术如多重PCR- 变性高效液相色
谱（MPCR-DHPLC，denaturing high
performance liquid chromatography）
等实现食源性致病菌、食品发酵工艺
微生物群落、乳酸菌等益生菌物种的
鉴定和多态性评价。
本文侧重生物信息和PCR 技术的
联合应用，概述目前国内外现行有效
标准，相关文献报道在微生物检测领
域、动物源性食品、食品中过敏原成分、
食品真伪鉴定等食品检测领域方面的
应用，发展趋势、存在的挑战、亟须
解决的问和最新进展。
1 食源性致病菌检测
食源性致病菌是食品安全风险监
测的重要对象，含蛋白、脂肪和水分
等营养成分高的食物也是各种细菌、
真菌和寄生虫的理想食物，当前食源
性致病菌检测技术向更加特异、灵敏、
快速和自动化方向发展[2]。
靶基因设计是微生物特异性鉴定的
关键，理想的靶基因能准确的将含靶
目标的生物和不含靶目标的生物区分开
来。微生物菌种属种的鉴定通常采用
16S rRNA 和23S rRNA 高度保守区、可
变区及16S rRNA 和23S rRNA 的间区。
对于亲缘关系远的通常采用16S rRNA
和23S rRNA 高度保守区，而同源关系
相近的种特异性常常选择16S rRNA 和
23S rRNA 的间区作为引物设计部位，
可能因为这些部位没有16S rRNA 和
23S rRNA 特异功能, 从而在物种进化过
程中没有受到较大的选择压力。以细菌
鉴定为目的选择的靶基因，首先考虑质
粒上的毒力因子，如毒力岛SP11 基因
之一的invA 基因对沙门氏菌的属鉴定。
因为通常毒力因子为菌株致病性的主要
因子，且对于大肠埃希氏菌和小肠结肠
耶尔森菌，通常认为只有产毒菌株才致
实时荧光PCR 技术在食品检验领域
的应用
□窦丽芳　李梦迪　方慧文　武汉产品质量监督检验所，国家饮料及粮油制品质量监督检验中心
摘　要：食源性致病菌、转基因食品等生物污染监测和控制是食品安全风险监测和控制的重要领域之一，核酸作为每
一物种独一无二的身份证明，在食源性致病菌、益生菌、动物源性食品、过敏原食品、转基因食品乃至食品真伪鉴定和检
测中是最理想的检测载体，结合强大的实时荧光PCR 核酸检测技术，为食品安全监测、风险评估及食品品质保障提供了有
利的技术支撑。本文对目前实时荧光PCR 技术在食品领域的应用和进展作一概述。
关键词：实时荧光PCR；食源性致病菌；转基因食品；食品过敏原；益生菌；动物源性食品；食品真伪鉴定
138 食品安全导刊 2015年7月
Technology
科技
科技文苑
病, 所以毒力基因为靶基因检测这两种
菌对于食品微生物筛查才有意义。但有
些毒力基因不稳定, 在实验室操作过程
中容易丢失, 可能导致PCR 检测的假阴
性，所以尽量选择受外界因素干扰小、
稳定的靶基因，如志贺氏菌ipaH 基因，
多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒
上，不随传代而丢失，具备较好的稳定
性和特异性。而有些毒力基因在多个种
属间具有较高同源性，可能导致PCR 检
测的假阳性，所以可以联合几种靶基因
多重PCR，增加检测的特异性，如加拿
大MFLP-23 标准检测副溶血性弧菌选
择物种特异性基因16S rRNA 联合毒性
基因r72h、溶血素tdh 和trh 基因多重
PCR 检测[2]。此外，阴性对照菌株和阳
性对照菌株选择的覆盖面及PCR 实验验
证也是特异性检测的重要保障。
食品中微生物分布具有随机性、
低丰度和分类广等特点。目前对食源
性微生物检测模式主要为目标检测菌
的选择性富集培养结合单重或多重
Real-Time PCR 技术。对食物样品先
行富集再行检测可以增加样品中微生
物绝对数量，初筛和分离纯化目标微
生物，且在一定程度上保证检测的活
菌，增强食品安全监测和评估的真实
性和准确性[3]。多篇文献报道显示，
Real-Time PCR 检测致病菌灵敏度为
2.0×102 ～ 1.0×103, ，模拟自然污
染进行人工加菌检测富集培养一定时
间后Real-Time PCR 检测灵敏度，每
25g 样品为1 ～ 5CFU[4、5、6]。但是，增
菌培养基中食品基质含量远远多于待
检微生物的量，食品复杂基质、培养
基共提取物等都会严重影响基因组DNA
的分离和提取质量，选择合适方式对
菌种进行选择性吸附和浓缩并对核酸
提取质量有效评价是保证Real-Time
PCR 检测灵敏、特异的又一关键环节。
可以采取对琼脂平板或选择性平板分
离的纯菌落进行鉴定或通过对样品进
行合理的稀释、离心或过滤方法先行
去除大的食物颗粒, 提取DNA 之前利
用差速离心、免疫磁珠分离、稀释和
加入牛血清白蛋白将细菌从食品基质
中分离出来等方式解决。
PCR 联合质谱和分子指纹的技术联
合，多重靶基因检测的多重PCR 靶基
因联合以及富集培养和PCR 结合的模
式联合，保证了Real-Time PCR 能够
胜任食品安全快速筛查检测的重任。
SNT 2562-2010， 采用多重PCR 联合
DHPLC 技术， 选取胶原酶基因，CTXA
基因，TCPA 基因和LPSgt 基因对霍乱
弧菌实现01、0139 和非01/0139 的
快速分群检测。SNT 2797-2010，选取
ETEA lt 基因，EHEC rfbE 基因，EIEC
ial 基因和EPEC bfp， 采用MPCRDHPLC
技术快速对食品中致泻大肠埃
希氏菌分群鉴定。SNT 2143-2008，
联合PCR 与RFLP 技术检测水果、果
汁、牛奶、叶类蔬菜及贝壳类中的隐
孢子虫。SNT 2563-2010，采用MPCRDHPLC
技术实现对肉及肉制品中常见的
沙门invA、单增PfrA、空弯CdtA、小
肠结肠耶尔森16SrRNA、金葡FemA、
溶链Cfb 等 6 种致病菌的同时检测。
与传统培养镜检生化血清传统
微生物检测模式相比，Real-Time
PCR 检测更加快速、灵敏、简便，
目前各PCR 实验室主流PCR 仪主要
为AB 公司7700 、7500、79 系统；
Roche 公司的LightCycler 系统；Bio
Rad 公司iCycler Thernal 、Cycler
系统以及Organon Teknika 公司的
NucliSensEasyQ 系统，实现检测的自
动化。食源性致病菌研究工作还要进
一步深入，在掌握更多生物信息的基
础上，结合PCR 仪器检测优势，向食
源性真菌毒素、寄生虫、食源性病毒
等更深入的领域探索。
2 益生菌检测
乳酸菌因能改善肠道微态平衡促
进人体健康，近年来被广泛关注。卫
生部2010 年65 号文（卫办监督发〔
2010〕65 号）规定我国可用于食品的
乳酸菌种主要包括嗜酸乳杆菌、干酪
乳杆菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆
菌等乳杆菌属14 个菌种；包括青春双
歧杆菌、动物双歧杆菌（乳双歧杆菌）、
两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双
歧杆菌和长双歧杆菌的双歧杆菌属6
个菌种。酸乳发酵剂中不同种类乳酸
菌不同发酵乳的产酸、产黏、产香及
分解蛋白质的能力不同，直接影响酸
乳的口感和品质。食品工艺和食品安
全的要求决定对乳酸菌在菌株水平的
鉴定至关重要。而目前双歧杆菌属菌
株水平鉴定仅限于培养法GB478.34-
2012，不仅生化鉴定繁琐且要需要
气相色谱法鉴定乙酸、乳酸等有机酸
代谢产物，费时费力。乳杆菌属水平
鉴定仅有普通PCR 方法SN 1941.3-
2007，而菌株水平的鉴定仍只能参考
培养法GB4789.35-2010，且培养法和
目前全自动生化鉴定仪菌株数据库还
不能全部覆盖所有14 个菌种，检测方
法上存在真空。
目前对乳酸菌菌种鉴定和鉴别的
研究较多，属种间鉴定仍然采用16S
July 2015 CHINA FOOD SAFETY 139
科技文苑
rRNA 序列，有报道该靶基因可以鉴别
鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、两歧双
歧杆菌和长双歧杆菌，但不能鉴别干
酪乳杆菌和副干酪乳杆菌[7]。基因指
纹图谱技术如RAPD、RFLP、DGGE、
ARDRA ( 核糖体DNA 扩增片段限制性
内切酶分析，amplified ribosomal
DNA restriction analysis) 和PCR 联合
技术如Rep-PCR ( 细菌基因组重复序
列PCR 技术，repetitive extragenic
palindromic PCR), TAP-PCR ( 三重随机
引物PCR, triplicate arbitrary primed
PCR)有很强的种间鉴定和鉴别能力[8]，
但目前仅限于研究，而要广泛常规开
展需要进一步探索。
3 动物源性成分检测
近年来，疯牛病、羊瘙痒病及禽
流感等疾病的出现，人们对畜、禽等
肉制品的食用安全和食用品质更加关
注，以及宗教、经济和市场监管的需
要共同催生了对动物源性成份的鉴定
和鉴别检测的需求。DNA 作为动物源
性成分检测的对象，不存在蛋白质成
分易被加工处理而被破坏、变性，难
以鉴别的弊端，因其在各种肉制品加
工过程中很稳定，适用于对未加工和
深加工食品, 包括生鲜、冷冻和熟热
制品等各种食品状态的检验。目前对
各类肉制品检测的靶基因主要为真核
生物18S rRNA 基因和线粒体细胞色素
b 基因等属特异性基因，SN/T 2051-
2008 采用Real-Time PCR 对食品、饲
料和化妆品中牛、羊和猪源性成分进
行鉴定；Tanabe[9] 和Jonker[10] 建立了
TaqMan MAG 探针多重Real-Iime PCR
体系对混合猪肉、鸡肉、牛肉、和马
肉等肉制品同时进行定量检测。该技
术实现对食品品质和真伪的检测和鉴
定，以便有效的辨别真伪。但要注意，
采用该技术对肉类成分鉴别通常为排
除法或反向鉴定，如在商家声称为驴
肉的产品中检出猪肉成分，证明该商
家以次充好，从而保护消费者的知情
权和选择权。
4 食品真伪鉴定
DNA 作为每一个物种独一无二的
身份证明，我们可以借助物种特异性
靶基因逆向思维对可能掺假的成分进
行鉴定，采用核酸检测方法进行制假
和鉴假的博弈。中秋将至，有些不法
商贩受利益驱使，以低成本的芸豆
或冬瓜冒充莲蓉，GBT 23814-2009
通过常规PCR 方法检测莲蓉馅中莲
子NNEA0732 和芸豆AB070627 内参基
因，从而判断莲蓉馅月饼中是否含有
芸豆成分，而我们实验室在此标准基
础上成功研制莲蓉制品中芸豆成分的
TaqMan 实时荧光PCR 方法, 并针对莲
蓉中淀粉成分多核酸成分少的弊端对
核酸前处理步骤进行了优化，核酸得
率和纯度较高。目前正在研制鉴定冬
瓜的TaqMan Real-Time PCR 方法。而
蜂蜜造假是长期以来关注的问题，目
前认为SM-R 大米糖浆、β- 呋喃果糖
苷酶、碳四植物糖和薄层色谱鉴定高
果糖浆四种指标可推荐为蜂蜜真实性
检测指标，检出阳性者可怀疑含有掺
假成分。目前江苏出入境研制的辨别
蜂蜜中大米糖浆的实时荧光PCR 法已
通过审定，通过鉴定大米内参基因 而
判断蜂蜜中是否掺入大米糖浆。而借
助这种思维，对地沟油中动物性成分
检测可能为地沟油的鉴别提供另一种
思路。
5 食品过敏原成分检测
食品过敏原问题也是威胁健康的
重要问题，逐渐引起社会关注。食源
性过敏源常发生于过敏体质人群，主
要由IgE 免疫球蛋白介导的Ⅰ型超敏
反应，严重者会威胁生命。对过敏体
质人群来说，主要是外源蛋白都可引
起反应，所以食源性过敏原类别具有
个体特异性[11]。常见于畜禽类、水产
品类、坚果类、水果类、农产品类和
鸡蛋牛奶蛋白类等蛋白含量高的食品。
基于核酸的过敏原检测选取物种特异
性基因作为靶基因，如编码大豆植物
凝集素Lectin 基因、编码玉米植物醇
溶蛋白ZEIN 基因、编码油菜磷酸烯醇
式丙酮酸羧化酶PE3-PEPcase 基因和
编码马铃薯蔗糖合成酶SSG 基因等；
SN/T 1961.2-2007 建立了检测食品中
花生成分过敏原的实时荧光PCR 方法；
Tanabe 等建立了PCR 技术，用来验证
标签中标识的过敏原成分和鉴定深加
工食品组分的中隐性过敏原成分。但
要注意，由于机体的过敏活性由蛋白
空间构象介导，单纯检测核酸只能说
明该食物中可能存在致敏成分，如果
蛋白被破坏也可能检测到核酸成分。
6 转基因食品检测
转基因作物因其抗虫、抗病毒、
耐除草剂能力增强，从而提高产量、
增强营养价值或食物品质而被广泛用
于全世界的食品。全世界批准投入商
品化转基因作物达几十种，包括美国
孟山都公司(Monsanto) GTS40-3-2 和
MON89788 大豆，MON810、MON863、
MON88017 和NK603 玉米，GT73 油菜，
15985BollgardII 保铃棉、MONey88913
抗农达Flex 棉花、1445 抗农达棉和
140 食品安全导刊 2015年7月
Technology
科技
科技文苑
531 抗虫棉，H7-1 抗农达甜菜； 瑞
士先正达（Syngenta） 公司Bt176、
Bt11、MIR604 玉米；美国陶氏益农、
杜邦先锋育种公司TC1507、59122
玉米； 德国拜耳A2704-12 大豆，
T25、T45、Topas19/2、Oxy-235 和
Ms1Rf1-3 油菜，LLCOTTON25 棉花。
农业部公布数据显示，自2004 年以来，
我国获得审批进口的转基因农产品达
79 批。目前，国内外对转基因食品的
安全性存在争议，各国法律法规对转
基因食品的种植、食用及进出口都有
严格要求，我国《转基因食品卫生管
理办法》和《农业转基因生物标识管
理办法》对转基因成分的标签标识也
有明确规定。
民众对转基因食品知情权和选择
权、法律法规对转基因食品的要求以
及食品安全监管的责任要求我们能从
类别繁多、成分复杂的食品中快速筛
查并鉴定出是否有转基因成分（筛选
基因检测），为何种转基因成分（基
因特异性检测）并能准确鉴定出其品
种品系（品种特异性检测）。目前转
基因产品检测为筛选、定性和鉴定三
步骤。第一步筛选检测：即通过检测
大部分转基因产品中插入的公共基因
元件如CaMV35S、FaMV35S 启动子、
NOS 终止子、标记基因NPT Ⅱ、Bar 或
PAT 基因初步判断是否有转基因成分，
通用元件和标记基因通常用于初筛，
几乎无特异性。但由于不同商品化品
种插入的公共基因元件的类型和组合
方式不同，单个基因初筛存在假阴性，
而初筛为阴性就不进行后面定性和鉴
定步骤了，容易导致漏检。第二步定
性检测：判断转入外源基因的类型，
初筛为阳性，进一步做基因特异性检
测， 如来源Agrobacteriun sp CP4 菌
株的耐受草甘膦类除草剂的CP4-EPSPS
基因，来源Bucillus thuringiensis 菌
株抗鞘翅目害虫的cry3Bb1 基因等。
但由于相同的基因特异性基因可能在
相同或不同的植物中表达形成新的具
有相同农艺性状的品系或新的转基因
植物，因此基因特异性检测方法不能
特异性的区分具有相同农艺性状的转
基因植物及其品系，在建立基因特异
性检测的同时还需引用其他基因进行
辅助。第三步鉴定检测：判断转基因
产品的品种品系，即品系特异性检测。
通过检测外源插入载体与植物基因组
的连接区序列实现，如BT11 品系鉴定
基因cry1A(b) 与adh1-IVS6 边界序列、
GA21 品系OTP 与EPSPS 边界序列以及
T25 品系鉴定CaMV35S 与PAT 边界序列
等。由于每一个转基因植物品系都具
有特异的外源插入载体与植物基因组
的连接区序列，并且连接区序列是单
拷贝，所以品系特异性检测方法具有
较高的特异性和准确性。
因此选择合适的筛查和鉴定方法
是当前转基因检测亟待解决的问题。
我们对转基因作物和转基因产品现行
有效方法标准进行初略统计，主要有
GB/T 19495-2004 系列8 个标准、SN
普通定性和荧光定量标准19 个，农
业部涉及安全评估和定性定量检测标
准20 个以及农业部869 号、953 号、
1193 号和1485 号公告共60 余个标
准，但这些方法多为某一具体品系单
重PCR 鉴定，难以满足对大量未知信
息样品的快速筛查要求。100 多个标
准中， 仅GB/T 19495.5-2004、SN/T
1204-2003、SN/T 1943-2007 和SN/
T 2584-2010 等少数几个标准为Real-
Time PCR, 其他多数为传统PCR 方法，
需要凝胶电泳等后处理步骤，耗时且
不同同时筛查多个基因，无法满足快
速、准确筛查和鉴定的目的。而多重
PCR 方法可以担当此重任，但快速和准
确的关键是对联合的靶基因的选择。
有报道借鉴管理学上的“矩阵法”根
据商品化转基因产品的基因分布特
点，筛选出合适的组合基因。而也有
多篇文献报道，联合初筛基因组合如
CaMV35S、NOS、FaMV35S 和Bar 进行四
重PCR 转基因筛查策略。但是，由于
不同作物使用的基因元件和外源基因
的种类和频次各不相同，因此不同作
物需根据具体情况采取合适的筛查策
略，本实验室目前正在进行这方面的
研究工作。
7 挑战和展望
食品检测技术的迅猛发展，既为食
品检测方法提供机遇，也带来了巨大的
挑战。由于食品的种类繁多、基质复杂、
影响和干扰因素多，且食品检测中的靶
基因类别繁多：原核生物、真核生物；
细菌、病毒、寄生虫；动物成分、植物
成分；原材料食品、加工和深加工食品
等，而食品中检测的核酸多为痕量，这
些都给获得高质量和高纯度的核酸带来
挑战，而核酸质量的好坏决定PCR 检测
的成败，所以选择合适的核酸提取和纯
化方式至关重要。
核酸的提取原则是将核酸与蛋白
质、多糖、脂肪等生物大分子物质分
开，且在提取过程中保证核酸分子一
级结构的完整性并排除其他物质的污
染和干扰。大多数核酸分离纯化一般
July 2015 CHINA FOOD SAFETY 141
科技文苑
为细胞裂解、酶处理、核酸与其他生
物大分子分离、核酸纯化等几个主要
步骤，每一步骤又可由多种不同的方
法单独或联合实现。目前常用的有物
理裂解法，如颗粒匀浆法、液氮研磨、
超声裂解、微波裂解等；化学裂解法，
如CTAB 法、PVP 法；酶法，如溶菌酶
或蛋白酶K 破壁，且分解蛋白释放核
酸。然后根据核酸和待分离物质理化
性质的差异, 用选择性沉淀法，如酚-
氯仿法、胍- 氯仿法；层析法，如磁
珠、玻璃、硅土或硅胶等固相载体选
择性吸附而将核酸分离和纯化。目前
磁珠法提取核酸因其得率高、纯度好、
成本低、快速、简便、节省人力以及
易于实现自动化等优点而被广泛使用。
但是，具体实验中选择哪种或哪几种
核酸提取方式，要根据细胞类型、待
提取的核酸类型及后续实验目的综合
考虑。在实验设计时结合设立的从提
取到扩增全过程对照系统和对核酸纯
度、浓度、完整性和质量评估的评价
体系，从操作和评价两个层面共同保
证核酸提取质量满足特异和准确PCR
检测的需要。
实时荧光定量PCR 进行的定量检测
还不能实现真正意义的绝对定量，我们
现在对实时荧光PCR 数据处理的Livak
法即2- △△ CT 法、用参照基因归一的
△ Ct 法以及Pfaffl 法都是基于“归一
化”数学思想建立的依赖Ct 值的相对
定量。但是，目前研制的第三代微滴式
数字PCR 系统（Droplet Digital PCR）
能实现真正意义上的绝对定量，靶序列
的起始浓度不再依赖Ct 值，而是直接
给出。该系统系统主要由微滴发生器和
微滴分析仪组成。微滴发生器（droplet
generator）将含有核酸分子的反应体
系形成成千上万个纳升级的微滴，其中
每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者
含有一个至数个待检核酸靶分子，且每
个微滴都作为一个独立的PCR 反应器。
经PCR 扩增后，采用微滴分析仪（droplet
reader）逐个对每个微滴进行检测，有
荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信
号的微滴判读为0（因此该技术被称为
数字PCR），最终根据泊松分布原理以
及阳性微滴的比例，分析软件可计算出
待检靶分子的浓度或拷贝数。
数字PCR 为绝对定量，乃至食品检
测提供了一种全新的技术思路与手段，
随着人类对更多生物体的测序完成，
我们对地球上更多生命体生物信息的了
解，相信我们对食品生物安全的鉴定、
鉴别、监测和评估会上升一个新的台阶。
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作者简介：窦丽芳（1980-），女，
硕士，工程师。研究方向：食品微生
物及分子生物学检测技术研究以及实
验室管理和标准体系。

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